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BIACORE蛋白与糖结合作用测试(CM5芯片)

2020-09-22 任剑刚 点击:[]

利用Biacore 检测蛋白与糖结合的亲和力数据KD。本实验采用CM5芯片偶联蛋白,糖分子作为分析物检测结合的亲和力。
一、实验使用机型、试剂和耗材
1、本实验所用的机型:Biacore T200 。
2、传感芯片:CM5 芯片。购自为 GE Healthcare。
3、氨基偶联试剂盒:购自为 GE Healthcare。
4、缓冲液:10 x HBS-EP+,10×PBS-P+pH 7.4,购自为 GE Healthcare。
5、去离子水(0.22 μm 膜过滤)。
6、配体蛋白:分子量为24kD,如果为商业化蛋白粉末,用水稀释到 200 μg/ml,分装在 -20℃保存。提前确定蛋白的活性,在进行溶解时,确保溶解液不含Tris 等带有伯氨基团的成分。
7、糖:母液浓度为1mM,样品体积在 200 μL 以上,纯度>90%。
8、再生溶液 Glycine 1.5 ,Glycine 2.0,Glycine 2.5,Glycine 3.0,购自为 GE Healthcare。
9、其他耗材: 1.5 ml EP 管,96孔板。
二、实验步骤
(一)开机

操作视频

(二)样品稀释
1、运行缓冲液:本实验缓冲液选用的是PBS-P,将10× PBS-P+pH 7.4 稀释10 倍,至少配置200 mL 的运行缓冲液。根据实验不同调整缓冲液的配置量。
2、配体浓度:用醋酸钠将配体溶液稀释至10 μg/ml,200 μL(至少保证1:20 的稀释比)。
3、糖浓度:用运行缓冲液将分析物浓度分别稀释为:1 mM, 333μM, 111 μM,36.6 μM, 12.2 μM, 4.1 μM, 1.36 μM, 0.45 μM,0.15 μM, 0.05 μM, 0 μM。
(三)配体偶联
1、偶联缓冲液:本实验缓冲液选用的是 HBS-EP。
2、偶联量计算:
根据以下公式可计算目标偶联量

其中,Rmax 为芯片表面最大结合容量,在蛋白测试中通常代入 100RU。analyte MW 和 ligand MW 分别为蛋白B 和蛋白 A 的分子量,Sm 为化学计量比,未知时选择1。Rl为配体偶联水平。实验时实际偶联量为1.5倍的 Rl。。
3、配体预富集
通过预富集实验,可以确定一个偶联的最佳pH值作为正式偶联时缓冲液的pH值。(CM系列芯片需要做预富集)
配体蛋白用醋酸钠 pH5.0, 4.5,4.0 分别稀释到 10 μg/ml (至少10倍稀释比),各准备 100uL。
通过预富集实验,确定pH4.5作为最佳偶联条件。故用 pH4.5 的醋酸钠将配体溶液稀释至 10 μg/ml,200 uL 进行正式的偶联操作。
4、配体偶联
本实验采用的偶联方式为共价偶联的程序偶联法

预富集及配体偶联视频
5、表面测试
通过芯片表面测试,我们需要确定:第一分析物是否和配体存在特异性结合;第二分析物和芯片表面是否存在非特异性结合;第三如何选择适当的分析物浓度进行后续的实验分析;第四如何选取正确的进样时间和解离时间。我们推荐在手动模式下进行芯片表面测试,以实现最大程度的灵活性。
操作视频
6、再生条件的选择

有效的再生条件对获得高质量的分析数据至关重要!直接关系到实验结果的重复性。合适的再生尽可能将与配体结合的残留的分析物分子从芯片表面彻底除去,还必须要保持芯片上配体分子的活性。
该程序通过分析物重复进样,以检测是否配体维持了原有的活性,是否能够去除所有剩余的分析物分子。

操作视频
(三)样品检测
操作视频
(四)数据分析
本实验采用亲和力分析。(
操作视频

(五)关机

操作视频


注意:
1、因糖类折光率高,故只有较强结合力的糖类分子才适用于本SOP。
2、此次实验结果为1.45×10-5 M,最终的亲和力结果根据样品不同有所不同。

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