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BIACORE蛋白与核酸相互作用测试(SA芯片)

2020-09-22 任剑刚 点击:[]

利用Biacore SA芯片检测核酸与蛋白结合的动力学数据ka、kd和亲和力数据KD。本实验使用的核酸为Lactosenatural operator O1(乳糖操纵序列O1,Lac O1),由23对互补碱基构成的双链DNA,DNA的5’端带有生物素化标签(5’-biotin-GAATTGTGAGCGGATAACAATTT-3’)[1],分子量约为14.5KD;蛋白为大肠杆菌Lactose operon repressor(乳糖操纵阻抑蛋白,Lac I),分子量为39.4 KD。本实验利用SA芯片固定生物素化修饰的Lac O1双链DNA,Lac I蛋白作为分析物检测其结合的动力学和亲和力数据。
一、实验使用机型、试剂和耗材
1、本实验所用的机型:Biacore T200 。
2、S系列SA芯片。购自为 GE Healthcare。
4、去离子水(用0.22μm膜过滤)。
5、生物素化修饰的核酸配体Lac O1:商业化合成的粉末,用水稀释到100μg/ml,分装保存在-20℃。对合成的核酸需要确认碱基组成和核酸的完整性,以及生物素化修饰的比例和纯度(本实验使用的生物素化修饰核酸由金唯智生物技术有限公司合成)。注:核酸的空间二级或三级结构可能对分析物的结合是至关重要的(如DNA、RNA适配体,双链DNA等),需要采用加热变性和缓慢冷却复性来保证核酸的结合活性。
6、Lac I蛋白分析物:母液浓度至少为10 uM,样品体积在50μL以上,纯度>90%。在选择蛋白供应商时,客户需要确认蛋白的活性,本实验使用了Novoprotein, #CG57。
7、其他耗材:无盖1.5 ml EP管,96孔板,购自为 GE Healthcare。
二、实验步骤
(一)开机

操作视频

(二)样品稀释
1、运行缓冲液:本实验缓冲液选用的是HBS-EP+,将10×HBS-EP+ (pH 7.4)用去离子水稀释10倍,至少配制200mL。根据实验不同调整缓冲液的配制量。
2、Condition 缓冲液:含50mM NaOH, 1M NaCl;至少配制1ml。
3、根据核酸配体与蛋白分析物的分子量,按1:1的结合比例,Rmax≦100,计算获得配体Lac O1的实际偶联量应≦55 RU。
3、核酸配体浓度:用运行缓冲液HBS-EP+ 将Lac O1溶液稀释至0.125 μg/ml,100μL(至少保证1:20的稀释比)。将稀释后的配体溶液置于95℃加热块中变性10 min,随后置于室温,自然冷却复性,有利于DNA双链结构的形成。
4、分析物浓度:用运行缓冲液将Lac I蛋白浓度梯度稀释至:20nM, 10 nM, 5nM, 2.5nM, 1.25nM, 0.625nM。
(三)配体偶联
1、偶联量计算:
根据以下公式可计算目标偶联量

其中,Rmax 为芯片表面最大结合容量,在蛋白测试中通常代入 100RU。analyte MW 和 ligand MW 分别为蛋白B 和蛋白 A 的分子量,Sm 为化学计量比,未知时选择1。Rl为配体偶联水平。实验时实际偶联量为1.5倍的 Rl。
2、配体偶联
本实验采用的偶联方式为捕获偶联的手动偶联法

操作视频
5、表面测试
通过芯片表面测试,我们需要确定:第一分析物是否和配体存在特异性结合;第二分析物和芯片表面是否存在非特异性结合;第三如何选择适当的分析物浓度进行后续的实验分析;第四如何选取正确的进样时间和解离时间。我们推荐在手动模式下进行芯片表面测试,以实现最大程度的灵活性。
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6、再生条件的选择

有效的再生条件对获得高质量的分析数据至关重要!直接关系到实验结果的重复性。合适的再生尽可能将与配体结合的残留的分析物分子从芯片表面彻底除去,还必须要保持芯片上配体分子的活性。
该程序通过分析物重复进样,以检测是否配体维持了原有的活性,是否能够去除所有剩余的分析物分子。

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(三)样品检测
操作视频
(四)数据分析
本实验采用动力学分析。(
操作视频

(五)关机

操作视频


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