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BIACORE抗体与抗原相互作用测试(NTA芯片)

2020-09-22 任剑刚 点击:[]

利用Biacore 检测FcRn 受体与IgG 结合的动力学数据kakd 及亲和力数据KD。受体FcRn 分子量为43.5KD,商业化蛋白带有His 标签;IgG 分子量为150KD。本实验利用NTA 芯片捕获FcRnIgG 分子作为分析物检测FcRn IgG 结合的动力学数据和亲和力数据。

一、实验使用机型、试剂和耗材

1、本实验所用的机型为:Biacore T200

2、芯片:NTA 芯片及试剂盒,购自GE Healthcare

3、缓冲液:10 × PBS-P + pH 7.4,购自GE Healthcare

4、去离子水(用0.22uM 膜过滤过)。

5、配体FcRn:如果为商业化蛋白粉末,用水稀释到100ug/ml 200ug/ml,分装在-20°C保存。推荐使用:Sinobio,用前确认FcRn的活性。

6IgG :母液IgG浓度至少在1.5 mg/ml,样品体积在200 ul以上,纯度>90%(即跑SDS-PAGE 胶有两条带)。如果IgG 中的盐离子浓度或多糖浓度过高可进行脱盐。

7、其他耗材:无盖1.5ml EP管,96 孔板、2型橡胶盖、96 孔板封口膜,购买地均为GE Healthcare

二、实验步骤

(一)开机

操作视频

(二)样品稀释

本次实验以一个FcRn 和两个抗体的相互作用为例。

1、运行缓冲液:如果缓冲液用的是10 × PBS-P + pH7.4 稀释为1 × PBS-P + 并将pH 调到6.0,至少配置500ml 的运行缓冲液。根据实验不同调整缓冲液的配置量。

2、配体FcRn 浓度:用运行缓冲液将配体溶液稀释至0.5ug/ml800ul

3IgG 浓度:实验中用运行缓冲液将IgG 浓度分别稀释为:3.0uM1.5uM0.75uM,0.325uM0.165uM0uM

(三)配体偶联量的调试

本实验采用的配体偶联为捕获偶联的程序偶联法,偶联程序和样品测试程序在一起。在运行程序之前需要进行配体偶联量的调试工作。调试工作采用手动运行的模式进行。

(四)配体偶联及样品检测

配体偶联量调试和配体偶联以及样品检测视频

(五)数据分析

本实验采用动力学分析。(操作视频

(六)关机

操作视频


 

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