仪器培训平台
当前位置: 生物分析测试中心 >> 仪器培训平台 >> 生物分子定性定量分析平台 >> 更多 >> 正文
更多

Biacore使用的注意事项

2020-09-22 任剑刚 点击:[]

1、注意:每次关机以后左侧的泵管夹需要打开。开机时合上。

2、不得在没有芯片的情况下运行任何程序包括standby。

3、当系统更换缓冲液或者芯片后,必须运行Prime程序。Prime 时缓冲液会冲洗整个流路系统,为下一步的实验做好准备。

3、样品舱舱门打开后会有时间限制,打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时,对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入,以免夹到手。可以等待舱门合上后,重新打开即可。

4、注意:EP管中不能有气泡,如有可离心去除。

5、运行Desorb所用的Desorb solution 1是SDS,平时请不要放在冰箱中。使用前请确认是否有沉淀,若有沉淀会导致系统管路阻塞。如果室温过低造成沉淀,请在使用前放在水浴中化开。

样品处理要求

一、使用纯化的分析物

样品不纯,会增加实验的复杂性,配体最好要达到90%以上。

二、尽可能确保样品缓冲液与运行缓冲液的一致性

1、用运行缓冲液以较大倍数稀释样品(至少20倍)

2、当稀释不足以减小差异,替换样品缓冲液

3、最小化容积折光率的影响

三、制备精确的浓度稀释系列

1、使用固定体积的系列稀释方法

2、浓度不准确会影响结果的准确性

四、尽可能确定活性分析物的浓度

1、分析物的浓度直接影响结合速率常数的计算

2、失活的分析物会降低其实际有效浓度

五、分析物浓度要求

分子间的作用强度有强有弱,常见的分子间亲和力常数KD值如下:

亲和素-生物素结合: 10−14 M

强的抗原-抗体结合: 10−8-10−10 M

DNA与蛋白的结合: 10−8-10−10 M

较弱的抗原-抗体结合:10−6-10-7M

酶与底物结合: 10−4-10−10 M

蛋白与小分子结合: 10−3-10−6M

实验前可根据亲和力常数大致范围来确定芯片表面测试是分析物的浓度,

如果KD值为nM级的时候,设置分析物浓度1-10-100 nM三个浓度。

如果KD值为mM级的时候,设置分析物浓度1-10-100 mM三个浓度。

如果KD值为μM级的时候,设置分析物浓度1-10-100 μM三个浓度。

六、蛋白样品制备的常见问题及解决策略

常见问题

解决方法

蛋白不稳定、降解

温和裂解

-哺乳动物细胞:添加去垢剂,如TWEEN20

-细菌:添加溶菌酶

-酵母:天剑酵母裂解酶

研磨匀浆

-组织样品:液氮,研钵&研棒

-细菌、细胞悬浮物:高压均质机、超声

防止降解、氧化

-蛋白酶抑制剂(PMSF)、还原剂(DTT

缓冲溶液控制:温度、pH、盐浓度

纯度低

除杂:离心、核酸酶消化、过滤

纯化:层析柱(亲和、疏水、离子交换、凝胶过滤)

缓冲体系不合适

置换缓冲液:脱盐柱

浓度低

样品浓缩:超滤浓缩管

 

上一条:高灵敏度化学发光凝胶成像系统使用说明 下一条:BIACORE的硬件组成及主要配件

关闭

Baidu
sogou